Notice
Détection sensible de Listeria monocytogenes viables par R-T PCR
Sensitive detection of viable Listeria monocytogenes by Reverse Transcription-PCR
Klein G.P., Juneja K.V.
Applied and Environmental Microbiology, 1997-11, Vol. 63 (11), p. 4441-4448 - Texte en Anglais
Résumé
La détection de pathogènes par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) dans les produits alimentaires contaminés peut donner des résultats faussement positifs en raison de l'amplification de l'ADN provenant de cellules non-viables. Une nouvelle méthode basée sur la transcription inverse-PCR (reverse transcription-PCR ou RT-PCR) d'ARNm (ARN messager) pour la détection spécifique de Listeria monocytogenes viable a été développée. L'expression des gènes iap, hly et prfA de L. monocytogenes a été examinée afin de déterminer une cible convenable pour l'amplification par RT-PCR. L'ARN total de L. monocytogenes a été isolé, suivi d'un traitement à la Dnase. L'ARN a été amplifié par RT-PCR et PCR avec des amorces (primers) spécifiques des trois gènes. La détection par système Amplicon a été achevée par Southern-hybridation avec la sonde du gène de la digoxigénine.
Le niveau d'expression de ces trois gènes se différencie nettement et les résultats indiquent que le gène iap peut fournir une bonne cible pour le développement d'une méthode spécifique de détection des cellules viables de L. monocytogenes basée sur l'amplification par RT-PCR. Après 1 heure d'enrichissement, l'ARNm spécifique du gène iap est détecté avec une sensibilité d'environ 10 à 15 UFC/ml dans une culture pure.
La détection de l'ARNm spécifique du gène hly est environ 4000 fois moins sensible après 1 heure, alors que la détection de l'ARNm spécifique du gène prfA montre la plus faible sensibilité, avec une détection non-observée après 5 heures de période d'enrichissement. L'amplification de l'ARNm du gène iap est spécifique pour L. monocytogenes.
Dans l'ensemble, l'essai a pu être poursuivi pendant 54 heures. L'utilisation de l'amplification par RT-PCR pour la détection de cellules viables de L. monocytogenes a été validée avec de la viande de boeuf cuite artificiellement contaminée. Après 2 heures d'enrichissement, l'amplification spécifique du mRNA-iap peut être détecté dans la viande de boeuf cuite inoculée avec environ 3 UFC/g. Ce résultat démontre l'utilité de l'amplification des ARNm par RT-PCR comme une méthode sensible pour la détection spécifique de cellules viables de L. monocytogenes et indique que cette méthode peut être très utile dans la détection de ce pathogène dans le produits carnés réfrigérés prêts-à-consommer.
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